產(chǎn)品簡(jiǎn)介

ProteanFect Max轉(zhuǎn)染試劑盒是全·球首·款自組裝蛋白納米顆粒核酸轉(zhuǎn)染試劑，專為原代細(xì)胞與難轉(zhuǎn)細(xì)胞系設(shè) 計(jì)，能夠?qū)崿F(xiàn)卓·越的外源基因遞送與表達(dá)。作為一種非病毒、非電轉(zhuǎn)、非脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑，ProteanFect Max能 高效且低毒性地轉(zhuǎn)染mRNA、siRNA、DNA 等多種核酸。該試劑操作簡(jiǎn)便，僅需 5-15 分鐘即可將核酸遞送至原代 細(xì)胞內(nèi)，最·快在 2 小時(shí)內(nèi)觀察到 mRNA 的表達(dá)效果。

試劑盒儲(chǔ)存與成分說明

ProteanFect Max轉(zhuǎn)染試劑盒在干冰中運(yùn)輸，收到后應(yīng)存放于 -20℃到-80℃，直至使用。試劑盒規(guī)格依據(jù) Reagent B的體積設(shè)定。試劑盒包含陽(yáng)性對(duì)照樣品，編碼綠色熒光蛋白（EGFP）的mRNA和質(zhì)粒DNA（pDNA）， 以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)操作及試劑效果。開封后，為確保試劑的最·佳性能，需根據(jù)表1中的存儲(chǔ)條件妥善保管各組分。

實(shí)驗(yàn)前材料準(zhǔn)備

? 待轉(zhuǎn)染細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前細(xì)胞必須處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，活率＞90%。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前一天需傳代更換新鮮培養(yǎng)基， 貼壁轉(zhuǎn)染需提前種板；對(duì)于部分原代細(xì)胞，建議在適當(dāng)活化后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

? 推薦培養(yǎng)基： Opti-MEM培養(yǎng)基（或無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)基/無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基），提前預(yù)熱或恢復(fù)至室 溫。

? 轉(zhuǎn)染試劑：室溫自然解凍，顛倒或渦旋至溶液均一后使用。

? 其他：完·全培養(yǎng)基，無(wú)菌EP管、所需轉(zhuǎn)染的核酸樣品。

a, 對(duì)于原代細(xì)胞，建議在轉(zhuǎn)染前進(jìn)行適當(dāng)?shù)募せ钐幚恚蕴岣咿D(zhuǎn)染效果。 b, 在配置 ProteanFect 轉(zhuǎn)染體系過程中，如出現(xiàn)輕微粘稠現(xiàn)象，屬正?，F(xiàn)象。體系配置完成后建議置于冰上保存；如需在室 溫下保存，須在 30 分鐘內(nèi)使用完畢。 c, 部分貼壁細(xì)胞可通過懸浮轉(zhuǎn)染方式提升轉(zhuǎn)染效率，即在轉(zhuǎn)染當(dāng)日將細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，后續(xù)操作流程與懸浮細(xì)胞一致。 d, 孵育時(shí)間可根據(jù)不同細(xì)胞類型進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。對(duì)于細(xì)胞系，孵育時(shí)間建議不超過 2 小時(shí)；對(duì)于原代細(xì)胞，孵育時(shí)間建議不 超過 45 分鐘。 e, 陽(yáng)性對(duì)照 mRNA 可在轉(zhuǎn)染后 5–48 小時(shí)內(nèi)檢測(cè) EGFP 表達(dá)；陽(yáng)性對(duì)照 pDNA 可在轉(zhuǎn)染后 24–48 小時(shí)檢測(cè) EGFP 表達(dá)； 轉(zhuǎn)染 siRNA 后敲低效率檢測(cè)建議在 48–72 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。

常見問題：

1.如何提升轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染條件需根據(jù)細(xì)胞類型和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

建議：

1）延長(zhǎng)轉(zhuǎn)染時(shí)間：根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)適當(dāng)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)染時(shí) 間。通常原代細(xì)胞不超過1小時(shí)，細(xì)胞系不超過2小時(shí)。

2）提升Reagent C用量：對(duì)于細(xì)胞系轉(zhuǎn)染，可在體系中添 加適當(dāng)?shù)腞eagent C，以96孔板為例，添加8-13.5 μL，孵育15分鐘，最長(zhǎng)不超過45分鐘；原代細(xì)胞則可將 Reagent C體積增加至13.5 μL，孵育時(shí)間同樣不超過45分鐘。

3）提升ProteanFect轉(zhuǎn)染量：適當(dāng)增加轉(zhuǎn)染體系至 初始的1.5-2.5倍。

2. 質(zhì)粒DNA能否用于原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染

雙鏈DNA轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞可能引起一定的毒性，例如炎癥應(yīng)激，因此需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹?jǐn)慎選擇。以人或小鼠 來源的原代T細(xì)胞為例，使用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染可能導(dǎo)致顯著的細(xì)胞毒性，因此不適合此類細(xì)胞。而大多細(xì)胞系通常經(jīng) 過多代培養(yǎng)，能更有效地應(yīng)對(duì)外源DNA帶來的壓力，對(duì)雙鏈DNA轉(zhuǎn)染的耐受性較高，因此可以使用質(zhì)粒DNA進(jìn)行 轉(zhuǎn)染。

3. 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染要求

轉(zhuǎn)染效率受DNA質(zhì)量影響。建議使用無(wú)內(nèi)毒素試劑盒制備DNA，并確保OD值在1.7-1.9之間；使用無(wú)核酸 酶純水將DNA稀釋至0.5-2 µg/µL的濃度。

4. 細(xì)胞系轉(zhuǎn)染前處理

1）為獲得良好的轉(zhuǎn)染效率，建議使用活性超過90%的細(xì)胞，可以通過臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞活性。2）不建 議使用傳代次數(shù)超過15次的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3）新復(fù)蘇的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前需傳代2-3次，待細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)后 使用。

5. 原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染前預(yù)處理

對(duì)于原代細(xì)胞，充分活化有助于提高轉(zhuǎn)染效率，因此建議在適當(dāng)活化后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。例如，人原代T細(xì)胞可 使用CD3/CD28磁珠或抗體進(jìn)行激活，激活2-10天內(nèi)均可轉(zhuǎn)染，其中激活4-7天時(shí)轉(zhuǎn)染效率高。

6. 關(guān)于試劑盒中陽(yáng)性對(duì)照的使用建議

首·次嘗試時(shí)，建議設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組（EGFP mRNA或EGFP pDNA），以檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作和試劑的有效性。 使用96孔板的細(xì)胞量即可，節(jié)省細(xì)胞和試劑。